PIPES缓冲液制备高效率感受态方法

发布时间: 2021-05-30

哌嗪二乙磺酸PIPES有(yǒu)多(duō)种缓冲液體(tǐ)系，其中缓冲溶液Transformation Buffer（也叫TB溶液）可(kě)用(yòng)于制备高效率感受态的细胞。

感受态是指细胞（或细菌）能(néng)够从周围环境中摄取DNA分(fēn)子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分(fēn)解时所处的一种特殊生理(lǐ)状态。有(yǒu)些细菌是自然感受态，如枯草(cǎo)芽孢杆菌，有(yǒu)些是人工感受态，如大肠杆菌。经过特殊方法处理(lǐ)受體(tǐ)细胞，可(kě)改变细胞膜通透性，使其成為(wèi)容许有(yǒu)外源DNA的载體(tǐ)分(fēn)子通过的感受态细胞。

感受态TB溶液原料——PIPES粉末

Transformation Buffer制备：

配制哌嗪二乙磺酸PIPES 3.0g 10mM、CaCl2·2H2O 2.2g 15mM、KCl 18.6g 250mM，加水 950ml，用(yòng)5N KOH 调PH至6.7-6.8*低PH不溶，再加终浓度為(wèi)55mM的MnCl2·4H2O 10.9g定溶到1升，过滤灭菌，4度保存。

感受态细菌细胞的转化采用(yòng)氯化钙的方法。液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌，在LB平板上划線(xiàn)，37度过夜至長(cháng)出单菌落。挑直径1-3mm 的菌落接种到250ml/3L锥形瓶或80ml/1L 锥形瓶的SOB培养基。在18度150-250RPM 培养19-50h。当OD600约0.4-0.8时停止培养，放在4度冰水中冷却10min，300RPM离心15min，回收菌體(tǐ)去掉上清后，用(yòng)1/3體(tǐ)积的冰冷TB溶液悬浮，在冷10min再次离心回收菌體(tǐ)用(yòng)1/12.5體(tǐ)积的TB悬浮，添加最终浓度為(wèi)7%的DMSO，再冷却10分(fēn)钟0.1-1ml 分(fēn)装，直接在液氮或-80度保存。

悬浮大肠杆菌的TB溶液中，主要其作用(yòng)成分(fēn)包括缓冲液PIPES和使细胞转化成感受态的氯化钙。需要注意的是，该方法适用(yòng)不含有(yǒu)质粒的大肠杆菌菌株，而不适合大质粒，冻存后转化效率有(yǒu)降低的可(kě)能(néng)。另外，不同细菌菌株的最适宜OD600也是是不同的，需要根据不同试验调整。

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